Levothyroxin thường được dùng đường uống, cũng có thể tiêm tĩnh mạch hoặc tiêm bắp. Liều dùng phải được điều chỉnh cẩn thận theo nhu cầu và đáp ứng của mỗi người bệnh. Vì liều lượng của thuốc có thể thay đổi theo thời gian, tuổi tác, tình trạng đáp ứng thuốc của cơ thể.

Thuốc hấp thụ ở hồi tràng, hỗng tràng và một ít ở tá tràng. Hấp thu dao động từ 48% đến 79% tùy thuộc vào một số yếu tố. Ðói làm tăng hấp thu và đỉnh hấp thu cực đại đạt được 2 giờ sau uống nhưng có thể lâu hơn từ 3-4 giờ nếu uống đồng thời với các thuốc, chất bổ sung, hay thức ăn đồ uống gây cản trở hấp thu khác. Do đó, các hướng dẫn hiện hành của Hiệp hội Tuyến giáp Hoa Kỳ khuyên bệnh nhân nên dùng levothyroxine ít nhất 60 phút trước ăn sáng hoặc trước khi đi ngủ (ít nhất 3 giờ sau ăn tối) và cách ít nhất 4 giờ so với các loại thuốc bổ sung khác, nếu có.

Việc sử dụng các loại thuốc khác trong khi dùng levothyroxin có thể gây ra một số phản ứng ngoài ý muốn như: Làm giảm sự hấp thu hoặc tăng tốc độ cơ thể đào thải levothyroxin hoặc gây ra thay đổi liên kết levothyroxin trong máu. Một số loại thuốc thường được sử dụng như thuốc ức chế bơm proton (PPI), statin, sắt, calci, magie, raloxifene, và estrogen... có thể cản trở sự hấp thu hormon tuyến giáp, sẽ khiến cho các bệnh nhân vốn trước đó đã được kiểm soát tốt khi dùng thuốc có thể bị nhược giáp.

Người bệnh không được uống thuốc đồng thời hormon này với các thuốc kháng acid (vì tác dụng gắn của canxi hoặc magie trong thành phần thuốc kháng acid), nếu cần phải sử dụng thuốc này thì nên dùng cách nhau 4 giờ.